原題：淺層X射線照射的間隔時間對瘢痕疙瘩成纖維細胞膠原分泌的影響
作者：鄭文月^1,2,馬季²,臧海英²,馮清藍^1,2,王維佳²,米次仁²,鄧成成²,朱定衡²

通信作者：朱定衡,碩士,主治醫師,E-mail：z127140@sina.com; 鄧成成,博士,副研究員，E-mail：dengchch@smu.edu.cn

作者單位：1.南方醫科大學，廣東  廣州  510515；2.南方醫科大學皮膚病醫院，廣東  廣州  510091

【引文格式】鄭文月,馬季,臧海英,等. 淺層X射線照射的間隔時間對瘢痕疙瘩成纖維細胞膠原分泌的影響[J].皮膚性病診療學雜志，2022,29（4）：285-290.

【基金項目】廣東省衛生健康委員會青年項目（A2019355）;院內臨床研究苗圃項目（C2019005）

 

[摘要] 
目的  探討不同間隔周期淺層X射線照射對人瘢痕疙瘩成纖維細胞及細胞外基質膠原蛋白表達的影響，確認最適輻照間隔時間。
方法  收集切除的瘢痕疙瘩組織分離培養原代瘢痕疙瘩成纖維細胞，實驗組進行不同時間間隔（1、2、3、4、5、6、7 d）淺層 X射線照射，總劑量均為15 Gy。采用實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）與Western blot檢測細胞內Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的相對表達，ELISA檢測細胞外上清Ⅰ型膠原蛋白改變，初步驗證淺層 X射線治療瘢痕疙瘩的最適輻照時間間隔。對照組與不同間隔周期淺層X射線照射組Ⅰ型、Ⅲ 型膠原蛋白含量的比較采用單因素方差分析；各組間Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白mRNA下降量比值行獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。
結果  與對照組相比，不同時間間隔淺層 X射線處理后瘢痕疙瘩成纖維細胞內Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達水平在間隔3 d（t=12.09，P<0.01）出現低峰值，Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達水平與對照組相比差異均有統計學意義（P<0.05）。間隔3 d mRNA水平檢測成纖維細胞內Ⅰ型膠原蛋白與Ⅲ型膠原蛋白的比值下降最明顯，差異有統計學意義（t=6.67，P<0.01）。除間隔7 d外,各實驗組HKF細胞中Ⅰ型膠原蛋白表達水平與對照組比較，差異均有統計學意義（P<0.01），在間隔1 d（t=9.97，P<0.01）出現低峰值；而HKF細胞中Ⅲ型膠原蛋白水平與對照組相比，差異均有統計學意義（P<0.01）。Ⅰ型膠原蛋白/Ⅲ型膠原蛋白比值在間隔前3 d逐漸升高，而間隔5 d（t=0.21，P＞0.05）和間隔7 d（t=0.66，P＞0.05）差異無統計學意義。所有實驗組ELISA檢測細胞外上清Ⅰ型膠原蛋白表達均下降（P<0.05）。間隔7 d照射組細胞內Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及細胞外上清Ⅰ型膠原蛋白表達均出現膠原分泌回升趨勢。
結論  照射間隔控制在3 d內能顯著降低膠原蛋白的表達，對臨床制定放射治療方案具有重要意義。 

[關鍵詞]   瘢痕疙瘩；  淺層X射線；  膠原；  成纖維細胞 

     

Effects of superficial X-ray irradiation therapy at different intervals on collagen secretion of keloid fibroblasts 

ZHENG Wenyue^1,2, MA Ji², ZANG Haiying², FENG Qinglan^1,2, WANG Weijia², MI Ciren²， DENG Chengcheng²， ZHU Dingheng²

1.Southern Medical University, Guangzhou 510515, China；2.Dermatology Hospital， Southern Medical University， Guangzhou 510091， China

Co-corresponding author:ZHU Dingheng,E-mail:z127140@sina.com; DENG Chengcheng, E-mail：dengchch@smu.edu.cn

[Abstract]  Objective  To investigate the effect of superficial X-ray irradiation at different intervals on the expression of collagen in human keloid fibroblasts and extracellular matrix, and to confirm the optimal irradiation interval. Methods  The excised keloid tissue was collected and cultured primary human keloid fibroblasts. The third passage cells were used to set up an experimental group and a control group. Intervals (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 days) with superficial X-rays. Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) and Western blot were used to detect the relative expression changes of collagen type Ⅰ and Ⅲ in cells. ELISA was used to detect the changes of type Ⅰ collagen in the extracellular supernatant, and preliminarily verified the optimal irradiation time interval for superficial X-ray therapy of keloids. One-way ANOVA was used to compare superficial X-ray irradiation groups at different intervals with the control group. The proportion of collagen type Ⅰ and type Ⅲ collagen mRNA decrease in each group was tested by independent samples t test. ResultsCompared with the control group, the expression level of type Ⅰ collagen mRNA in keloid fibroblasts in experimental group after shallow X-ray treatment at different time intervals showed a low peak at an interval of 3 days (t=12.09, P<0.01). The expression level of type Ⅲ collagen mRNA in experimental group had statistical significance decrease compared with the control group (P<0.05). The ratio of type Ⅰ collagen to type Ⅲ collagen in fibroblasts decreased most significantly at an interval of 3 days (t=6.67, P<0.01). The expression level of type Ⅰ collagen in HKF cells of each experimental group was significantly different from that of the control group (except for the interval of 7 days) (P<0.01), and there was a low peak at the interval of 1 day (t=9.97, P<0.01); The level of type Ⅲ collagen in HKF cells in experimental group was significantly different from that in the control group (P<0.01). The ratio of type Ⅰ collagen to type Ⅲ collagen increased gradually in the first 3 days, but there was no significant difference between the 5-day interval (t=0.21, P>0.05) and the 7-day interval (t=0.66, P>0.05). The expression of type Ⅰ collagen in extracellular supernatant of all experimental groups decreased by ELISA (P<0.05). The expression of type Ⅰ and Ⅲ collagen in cells and type Ⅰ collagen in extracellular supernatant of irradiation group showed a rising trend of collagen secretion after 7 days. ConclusionControlling the irradiation interval within 3 days can significantly reduce the expression of collagen, which is of great significance for the clinical formulation of radiotherapy. 

[Keywords］keloid;  superficial X-ray therapy;  collagen;  fibroblast 

---

     瘢痕疙瘩是成纖維細胞異常增殖、膠原過度累積的病理性瘢痕組織，存在與腫瘤相似的表觀遺傳學改變^[1-3]。單一治療手段難以達到理想的控制效果，手術聯合術后放療被證實能有效預防瘢痕疙瘩復發^[4]。目前臨床報道手術聯合早期淺層X射線放療對控制瘢痕疙瘩的復發更為有效^[5]。據報道，瘢痕疙瘩放療在5 Gy劑量組療效較對照組差異有統計學意義^[6]，且復發率與總劑量相關^[7]，而關于放療的最適間隔周期尚無定論。本研究旨在探討不同間隔周期淺層X射線照射人瘢痕疙瘩成纖維細胞（human keloid fibroblasts，HKF）后，HKF及細胞外基質膠原蛋白表達的改變。 
 

1  材料與方法

1.1  實驗材料

標本來源于2021年1月至2021年12月南方醫科大學皮膚病醫院行手術切除的瘢痕疙瘩標本6例，其中穩定期2例，進展期4例。所有瘢痕疙瘩患者均局部無感染潰瘍，未接受過任何藥物及放射治療。經臨床及病理確診后，所有標本取材均已獲得患者本人或監護人的知情同意。研究經醫院倫理委員會審批通過。

1.2試劑 

DMEM培養基(美國Thermo Scientific)，胎牛血清（FBS，以色列Biological Industries)，Trizol和PrimeScriptTM RT reagent Kit反轉錄試劑盒（日本Takara），上下游引物（上海生工生物工程有限公司），SYBR Green Premix qPCR Kit（湖南艾科瑞生物工程有限公司），兔抗人Collagen Ⅰ抗體（美國CST），兔抗人Collagen Ⅲ抗體（美國Abcam），Human Collagen Ⅰ ELISA Kit（南京建成生物工程研究所有限公司），SRT-100 VisionTM淺層放射治療系統（美國Sensus Health）。

1.3方法

1.3.1  HKF的分離培養于南方醫科大學皮膚病醫院手術室無菌條件下收集人瘢痕疙瘩組織用于提取和培養原代HKF。于超凈細胞臺用含雙抗的RPMI-1640培養液多次沖洗瘢痕組織，用剪刀盡量剪去真皮下脂肪組織，將每塊組織剪至約0.1 cm×0.1 cm大小的矩形，加入含血清的DMEM培養基，培養于37 ℃、5% CO2的細胞孵箱中，當細胞密度長至80%時，倒置顯微鏡觀察細胞，并進行傳代。本實驗中使用傳至第3代的成纖維細胞。

1.3.2  不同間隔周期淺層X射線照射HKF取4×105/孔處于對數生長期的HKF接種于培養皿中培養24 h。根據照射間隔時間不同，分別設間隔1、2、3、4、5、6、7 d 7個組，設置無照射空白對照組(0 d)，共8組。實驗中需照射細胞均采用S-100淺層X射線放射治療系統，1~7組分別間隔1~7 d進行照射，所有組單次照射劑量均為5 Gy，2-6 min，共照射3次;空白對照組不照射。

1.3.3  Western blot檢測各組HKF中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達   第22天（從實驗組第1次照射起算），收集8組HKF，裂解破碎細胞，收集細胞總蛋白，BCA法蛋白定量。制備好的蛋白樣品經SDS-PAGE凝膠電泳后，轉移至聚氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，分別加入稀釋的一抗，Ⅰ 型膠原蛋白（1: 1 000），Ⅲ型膠原蛋白（1:1 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入稀釋的酶標二抗，室溫孵育2 h。顯影，拍照定影，以GAPDH作為內參，分析蛋白表達水平。

1.3.4  qRT-PCR檢測各組HKF中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的mRNA表達水平   利用Trizol法提取細胞總RNA，采用反轉錄試劑盒進行反轉錄。PCR反應條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，90 ℃ 15 s。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT法分析目的基因mRNA相對表達水平。引物由中國生工生物工程公司合成(表1)。 
 

 

1.3.5  ELISA檢測各組HKF培養上清液中Ⅰ型膠原蛋白的表達 收集HKF培養上清液，ELISA檢測Ⅰ型膠原蛋白的分泌水平，實驗步驟嚴格按照ELISA檢測試劑盒說明書操作，最后在酶標儀中讀取各孔450 nm波長處的OD值，根據標準曲線計算各組HKF培養上清液中Ⅰ型膠原蛋白的濃度。
 

1.4  統計學處理 

采用 GraphPadPrism 9.0軟件進行統計學分析，數據以均數±標準差表示，結果至少經3次獨立重復試驗計算得出，對照組與不同間隔周期淺層X射線照射組比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2  結果

2.1  不同間隔周期淺層X射線照射對HKF中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達水平的影響 

不同間隔周期淺層 X射線照射處理后，與未處理組（0 d）相比，各實驗組HKF細胞中 Ⅰ 型膠原蛋白mRNA表達水平均明顯降低。其中，間隔3 d組（t=12.09，P<0.01）最低（圖1）；各實驗組HKF細胞中Ⅲ型膠原蛋白亦降低，差異均有統計學意義（P<0.05），其中，間隔3 d組Ⅲ型膠原蛋白表達出現升高值，與對照組有統計學差異（t=5.22，P<0.05，圖1）。Ⅰ型膠原蛋白/Ⅲ型膠原蛋白mRNA比值與未處理組相比，間隔3 d組下降值最明顯，差異有統計學意義（t=6.67，P<0.01），而間隔7 d Ⅰ型膠原蛋白/Ⅲ型膠原蛋白mRNA比值與未處理組相比，差異無統計學意義。
 

2.2  不同間隔周期淺層X射線照射對HKF中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達水平的影響 

不同間隔周期淺層 X射線照射處理后，各實驗組HKF細胞中Ⅰ型膠原蛋白與未處理組比較差異均有統計學意義（均P<0.05），間隔1 d組出現低峰值（t=9.97，P<0.01,圖2）;各實驗組Ⅲ型膠原蛋白水平與未處理組比較，亦有統計學差異（P<0.01）。與未處理組相比Ⅰ型膠原蛋白/Ⅲ型膠原蛋白比值在間隔3 d下降值最明顯（P<0.01），而間隔5 d（t=0.21，P＞0.05）和間隔7 d（t=0.66，P＞0.05）Ⅰ型膠原蛋白/Ⅲ型膠原蛋白比值無明顯變化，差異無統計學意義。

2.3  不同間隔周期淺層X射線照射對HKF培養上清液中Ⅰ型膠原蛋白表達水平的影響 

不同時間間隔淺層 X射線照射處理后，與未處理組相比，各實驗組HKF培養上清中Ⅰ型膠原蛋白分泌水平明顯降低，差異有統計學意義（均P<0.05）。間隔3 d（t=5.95，P<0.01）和6 d組（t=5.53，P<0.001）培養上清中Ⅰ型膠原蛋白表達出現兩個低峰值，呈一定的時間依賴性（圖3）。 

3  討論 

瘢痕疙瘩是臨床常見的病理性瘢痕，主要組織學特征為局部成纖維細胞過度增殖和細胞外基 質成分過度堆積^[8]。瘢痕疙瘩具有侵襲性生長、增殖和分化異常等特點，最關鍵的特點是有類似腫瘤的缺氧微環境^[9]，放射療法通過直接或間接電離作用抑制細胞分裂和增殖，作為腫瘤的主要治療手段之一，同樣適用于瘢痕疙瘩^[10]。目前研究表明，在不同劑量電離輻射作用下，放療后不同階段可通過激活整合素和生長因子受體增強輻射誘導的G2/M細胞周期停止、凋亡或其他生物學改變^[11]。HKF經電離輻射后引起DNA損傷誘導衰老表型，參與成纖維細胞的染色質重塑^[12]，且大量研究證據表明衰老與表觀遺傳密切相關^[13]。然而，放射治療通過改變細胞周期或微環境調控表觀遺傳網絡治療瘢痕疙瘩的具體機制還有待進一步研究。

淺層X射線聯合術后放療可以達到預防瘢痕疙瘩復發的目的^[14]。Sakamoto等^[7]指出瘢痕疙瘩術后生物學有效劑量(BED)為20 Gy，分5次治療后復發率為11%，認為瘢痕疙瘩復發率與BED呈劑量-效應關系。Flickinger等^[15]指出身體其他部位病變電子輻射劑量高于耳垂瘢痕疙瘩，且表明短療程、高分割劑量是防止復發的最佳策略。本研究采用一個特定總劑量（15 Gy）不同時間間隔（1~7 d）對HKF進行淺層X射線照射。Ⅰ型膠原是真皮細胞外基質（extracellular matrix, ECM）主要成分，當皮膚受傷或真皮修復期間，Ⅲ型膠原蛋白含量會暫時增加，延遲上調TGF-β3以及降低Ⅰ型膠原蛋白表達^[16]。本研究在不同間隔的各組經3次連續照射后，HKF內膠原分泌均較前減少，且間隔前3 d對細胞外上清中Ⅰ型膠原蛋白分泌水平均有顯著抑制作用（P<0.01）。而Ⅰ型膠原蛋白/Ⅲ型膠原蛋白比值在第1~3天隨時間間隔逐漸增高，第3天達最高水平（P<0.01）。以上結果共同提示照射間隔控制在3 d內，淺層X射線對HKF膠原蛋白的表達具有顯著影響。近期關于瘢痕疙瘩術后放射治療時機的Meta分析也總結了瘢痕疙瘩切除術后72 h內放射治療療效優于72 h后放射治療療效的結論^[17]。X射線輻射可通過控制成纖維細胞增殖，阻止細胞周期并誘導細胞過早衰老來防止瘢痕疙瘩復發^[18]。另外，細胞的無限增殖受關鍵調節點G1、G2及S期調控，間隔放射療法給予了細胞修復的時間，調節細胞周期G1期向S期轉換^[19]。周期蛋白D/CDK4磷酸化Rb使p53激活，可抑制周期蛋白E/CDK2，使周期停止，控制細胞循環，抑制細胞增殖^[20]。本實驗結果提示間隔1~3 d淺層X射線照射后可能存在使細胞損傷停留在不同階段如G1/S期、G2/M期，或使處于相對抗拒放射時相的細胞向放射敏感時相移動的再分布現象。

瘢痕疙瘩的形成是膠原不斷沉積的結果，局部微環境除了可通過自身DNA序列改變之外，還可通過表觀遺傳學改變DNA甲基化轉移酶及非編碼RNA影響瘢痕疙瘩成纖維細胞Wnt/β-連環蛋白信號通路和膠原蛋白的表達^[21]。一些文獻報道瘢痕疙瘩皮損及成纖維細胞p16基因低表達，輻射能誘導DNA甲基化模式發生改變和細胞周期相關基因p16、p21、p27 mRNA和蛋白水平明顯升高^[22]，但具體通過特定基因啟動子CpG島甲基化狀態及何種途徑，目前尚不清楚。本實驗通過細胞學體外實驗研究表明，淺層X射線可通過影響HKF膠原蛋白分泌周期抑制膠原產生，結合Pogribny等^[23]研究發現不同劑量X射線輻照HKF后出現衰老表型特征，DNA甲基化轉移酶mRNA表達水平降低，推測淺層X射線治療瘢痕疙瘩療效可能歸因于對HKF表觀遺傳學影響。本研究通過實時定量PCR和Western blot結果比較淺層X射線照射后HKFⅠ型膠原蛋白/Ⅲ型膠原蛋白比值，當兩次分割劑量時間間隔延長至4~7 d時，淺層X射線對成纖維細胞的膠原蛋白分泌作用在間隔5 d和間隔7 d出現回升趨勢，可能由于細胞分裂或再群體化，導致細胞增殖和膠原蛋白產生增加。為進一步證實不同時間間隔淺層X射線照射后細胞外膠原蛋白表達的影響，本研究利用ELISA實驗檢測培養基上清膠原蛋白含量，結果表明1~3 d和4~6 d膠原蛋白抑制率逐漸升高，可能存在淺層X射線照射后膠原蛋白最適抑制周期。瘢痕疙瘩除了通過COL1A1信號通路影響HKF的形成和凋亡，還受到缺氧環境等復雜微環境的影響，因此進一步探討淺層X射線照射對細胞分裂周期相關蛋白及表觀遺傳學改變的影響，可能是本課題未來的研究方向。

綜上所述，本研究證明了淺層X射線對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和膠原分泌的抑制作用，推測高張力部位需給予足夠大的輻射劑量，且照射間隔控制在3 d內對預防瘢痕疙瘩復發具有重要意義，隨著間隔時間延長，膠原蛋白分泌出現回升趨勢，但確切的分子機制還有待深入研究，最佳放射治療間隔周期還需結合臨床綜合評估。
[聲明]本文作者享有本文著作權，《皮膚性病診療學雜志》專有本文出版權和信息網絡傳播權,本網分享僅為科普無盈利目的。

[參考文獻]

[1]ZHANG T, WANG X F, WANG Z C, et al. Current potential therapeutic strategies targeting the TGF-beta/Smad signaling pathway to attenuate keloid and hypertrophic scar formation[J]. Biomed Pharmacother, 2020,129:110287.

[2]LV W, REN Y, HOU K, et al. Epigenetic modification mechanisms involved in keloid: current status and prospect[J]. Clin Epigenetics, 2020,12(1):183.

[3]LIMANDJAJA G C, NIESSENI F B, SCHEPER R J, et al. The keloid disorder: heterogeneity, histopathology, mechanisms and models[J]. Front Cell Dev Biol, 2020,8:360.

[4]HUANG C, LIU L, YOU Z, et al. Managing keloid scars: from radiation therapy to actual and potential drug deliveries[J]. Int Wound J, 2019,16(3):852-859.

[5]KAL B H, VEEN R E. Biologically effective doses of postoperative radiotherapy in the prevention of keloids Dose-effect relationship[J]. Strahlenther Onkol, 2005,181(11):717-723.

[6]中國整形美容協會瘢痕醫學分會. 瘢痕早期治療全國專家共識(2020版)[J]. 中華燒傷雜志,2021,37(2):113-125.

[7]SAKAMOTO T, OYA N, SHIBUYA K, et al. Dose-response relationship and dose optimization in radiotherapy of postoperative keloids[J]. Radiother Oncol, 2009,91(2):271-276.

[8]HUANG J, HENG S, ZHANG W, et al. Dermal extracellular matrix molecules in skin development, homeostasis, wound regeneration and diseases[J]. Semin Cell Dev Biol, 2022,128:137-144.

[9]MACARAK E J, WERMUTH P J, ROSENBLOOM J, et al. Keloid disorder: fibroblast differentiation and gene expression profile in fibrotic skin diseases[J]. Exp Dermatol, 2021,30(1):132-145.

[10]SHIH P C. The role of the STAT3 signaling transduction pathways in radioresistance[J]. Pharmacol Ther, 2022,234:108118.

[11]VEHLOW A V, CORDES N. Growth factor receptor and β1 integrin signaling differentially regulate basal clonogenicity and radiation survival of fibroblasts via a modulation of cell cycling[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2022,58(2):169-178.

[12]ISERMANN A, MANN C, RUBE C E. Histone variant H2A.J marks persistent DNA damage and triggers the secretory phenotype in radiation-induced senescence[J]. Int J Mol Sci, 2020,21(23):9130. 

[13]KANAKOGLOU D S, MICHALETTOU T D, VASILEIOU C, et al. Effects of high-dose ionizing radiation in human gene expression: a meta-analysis[J]. Int J Mol Sci, 2020,21(6):1938.

[14] SIOTOS C, UZOSIKE A C, HONG H, et al. Keloid excision and adjuvant treatments: a network meta-analysis[J]. Ann Plast Surg, 2019,83(2):154-162.

[15]FLICKINGER J C. A radiobiological analysis of multicenter data for postoperative keloid radiotherapy[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2011,79(4):1164-1170.

[16]RIPPA A L, KALABUSHEVA E P, VOROTELYAK E A. Regeneration of dermis: scarring and cells involved[J]. Cells, 2019,8(6):607. 

[17]周潤蕾,方立純,程代薇. 瘢痕疙瘩術后不同放射治療方案的Meta分析[J]. 中國美容整形外科雜志,2019,30(6):342-344.

[18]JI J, TIAN Y, ZHU Y Q, et al. Ionizing irradiation inhibits keloid fibroblast cell proliferation and induces premature cellular senescence[J]. J Dermatol, 2015,42(1):56-63.

[19]CARLOS-REYES A, MUNIZ-LINO M A, ROMERO-GARCIA S, et al. Biological adaptations of tumor cells to radiation therapy[J]. Front Oncol, 2021,11:718636. 

[20]VANARSDALE T, BOSHOFF C, ARNDT K T,et al. Molecular pathways: targeting the cyclin D-CDK4/6 axis for cancer treatment[J]. Clin Cancer Res, 2015,21(13):2905-2910.

[21]LIU J, ZHU H, WANG H, et al. Methylation of secreted frizzled-related protein 1 (SFRP1) promoter downregulates Wnt/β-catenin activity in keloids[J]. J Mol Histol, 2018,49(2):185-193.

[22]季江. 瘢痕疙瘩成纖維細胞電離輻射效應及誘導細胞早期衰老相關基因表達研究[D].蘇州:蘇州大學,2014.

[23]POGRIBNY I, KOTURBASH I, TRYNDYAK V, et al. Fractionated low-dose radiation exposure leads to accumulation of DNA damage and profound alterations in DNA and histone methylation in the murine thymus[J]. Mol Cancer Res, 2005,3(10):553-561.